ЭПОКСИДНАЯ ПЛАСТИНАЦИЯ

          Изучение топографической анатомии как одной из фундаментальных медицинских дисциплин предполагает использование натуральных анатомических препаратов. Еще в середине 19 века великий русский хирург Николай Иванович Пирогов предложил использовать срезы замороженных частей тела для обучения практической анатомии. Предложенный Н.И. Пироговым метод получил широкое распространение в России и за рубежом, так как с его помощью удалось получить совершенно новый класс анатомических препаратов, позволявших оценить взаимное расположение анатомических структур в двухмерной системе координат. Пироговский метод послужил основой для создания первого атласа распилов замороженных частей тела, что, в конечном счете, привело к появлению отдельной морфологической науки - топографической анатомии.

В настоящее время невозможно представить себе процесс обучения топографической анатомии без использования пироговских срезов. Однако, использование натуральных распилов частей тела в качестве учебных пособий имеет ряд недостатков, существенно ограничивающих их применение на лекциях и практических занятиях. Во – первых, при экспозиции на воздухе традиционные срезы быстро мумифицируются и деформируются, что затрудняет их дальнейшее использование для демонстрации и требует изготовления новых препаратов. Во – вторых, натуральные срезы тела являются непрозрачными объектами, поэтому на них не всегда возможно продемонстрировать мелкие анатомические структуры и оценить их взаимоотношение в срезанном сегменте. В - третьих, распилы головы, шеи, груди, живота и таза часто распадаются на отдельные компоненты вследствие отсутствия связей между анатомическими структурами, попавшими в плоскость среза. Это требует дополнительных усилий по прошиванию и фиксации таких структур хирургическим шелком. Не случайно, что из-за вышеперечисленных недостатков на некоторых кафедрах топографической анатомии предпочитают схемы и рисунки, вместо использования натуральных препаратов.

В начале восьмидесятых годов прошлого столетия немецкий анатом Гунтер фон Хагенс предложил использовать эпоксидную смолу для пропитывания тонких срезов тела, которые после отвердевания смолы приобретали прозрачность, твердость и были намного удобнее в практическом использовании [1, 6, 8]. Данный метод получил название эпоксидной пластинация (plastination) и был внедрен в практику института анатомии и клеточной биологии Гейдельбергского университета в Германии. В своих статьях автор особо отметил долговечность новых препаратов и возможность их использования практически в любой аудитории. Однако, в обозреваемых публикациях фон Хагенса и его последователей предложенный метод описывается лишь в общих чертах, что не позволяет применять эту методику для изготовления учебных препаратов и проведения морфологических исследований. Также ни в одной из прочитанных публикаций нам не удалось найти информацию по составу и физико-химическим свойствам эпоксидных смол, используемых для пластинации. Данное обстоятельство затрудняет использование эпоксидных смол, приобретенных на российском рынке. В обозреваемой литературе единственным источником для приобретения эпоксидной смолы указывается созданная Хагенсом немецкая компания “Biodur”, которая является поставщиком 90% оборудования и химреактивов для лабораторий пластинации во всем мире.

Материал и методы. В качестве экспериментальной модели нами был использована методика пластинации Гунтера фон Хагенса, состоящая из четырех последовательных стадий:

  1. Изготовление срезов
  2. Обезвоживание и обезжиривание
  3. Пропитывание срезов эпоксидной смолой
  4. Отверждение смолы в срезах

Для изготовления срезов тела человека и домашних животных замораживались в жидком азоте при температуре −195°C или в морозильной камере Dancar DS630 (Дания) при температуре −25ºC. Ленточной пилой Kolbe K430 (Германия) производили серии распилов частей тела человека в горизонтальной, фронтальной и сагиттальной плоскостях при скорости полотна от 20 до 50 метров в секунду. В экспериментальных целях были изготовлены срезы толщиной от 1 до 40 миллиметров. Полученные распилы очищали от образовавшейся стружки механическим путем, либо посредством промывания срезов в проточной водопроводной воде или в охлажденном ацетоне.

Обезвоживание срезов производили в возрастающих концентрациях этилового спирта, ацетона или смеси ацетона с гексаном в течение 7 суток при температуре от −10 C до −25 C. Контроль за процессом обезвоживания осуществляли путем измерения плотности обезвоживающего раствора с помощью спиртометра или расчетным методом. Обезвоживание завершали, если концентрация воды в растворе понижалась до 1%. После обезвоживания препараты обезжиривали при комнатной температуре путем погружения срезов в чистый ацетона или хлористого метилен, а также в смесь ацетона с гексаном в соотношении 3:1. Обезжиривание считалось завершенным, если обезжиривающий раствор не изменял цвет после экспозиции срезов в течение 7 суток.

Для приготовления импрегнационной композиции были использованы предлагаемые на российском рынке оптически прозрачные эпоксидные смолы ЭД-20 и YD-128 с коэффициентом преломления от 1,3 до 1,6 единиц. Пропитывание срезов смолой осуществляли при комнатной температуре путем погружения обезвоженных и обезжиренных срезов в смесь эпоксидной смолы ЭД-20 и отвердителя ТЭТА в соотношении 20:1 с последующим помещением в вакуумную камеру и плавным снижением давления с помощью пластинчато-роторного вакуумного насоса Гидромех АВПР-16Д (Россия). При падении давления ниже 300 мбар в срезах происходило образование пузырьков промежуточного растворителя, которые всплывали на поверхность, а их место в тканях замещалось эпоксидной смолой. Интенсивность импрегнации зависела от глубины вакуума в камере, что регулировалось с помощью игольчатого крана и контролировалось манометром. Важное значение имел также визуальный контроль за скоростью всплывания и размерами пузырей промежуточного растворителя. Процесс импрегнации завершался после прекращения выхода пузырьков растворителя на поверхность смолы.

Для отверждения срезы извлекали из импрегнационной композиции и оставляли на столе в течение 1 – 2 часов, что давало возможность избытку смолы стекать с препаратов. После чего, срезы помещали в плоские камеры из полиметилметакрилата и заливали новой смесью эпоксидной смолы ЭД-20 (YD-128) с отвердителем ТЭТА в соотношении 10:1. Образовавшиеся в процессе заливки пузырьки воздуха удаляли специальными иглами или посредством нагревания эпоксидной смолы потоком теплого воздуха. После полного застывания смолы срезы извлекали из плоских камер и обрезали ленточной пилой до нужного размера.

Результаты исследования и их обсуждение.

Установлено, что оптимальная демонстрация всех анатомических образований на пластинированных срезах достигается при изготовлении распилов толщиной от 3 до 5 мм (рис.1, 2). Для изготовления более толстых пластинчатых срезов потребовалось в среднем в 1,5 раза больше времени на этапах импрегнации и отверждения. Срезы толщиной более 10 мм получались непрозрачными и не могли быть использованы для исследования в проходящем свете.

                                                   

Рис. 1. Пластинированный фронтальный распил головы через зуб осевого позвонка

              

Рис. 2. Пластинированный горизонтальный распил грудной клетки через суставы головок третьих ребер.

Установлено, что для изготовления пластинчатых срезов по данной методике могут быть использованы как фиксированные, так и нефиксированные анатомические объекты. Отмечено, что на срезах, полученных от трупов, которые фиксировались с применением вязких жидкостей, таких как глицерин или этиленгликоль, наблюдалось значительное сморщивание нервных структур.

Дополнительная инъекция сосудистого русла и полых органов окрашенными силоксановыми композициями позволила получить более информативные срезы (рис. 3). Однако, полимеризовавшийся в крупных сосудах силикон при распиливании нередко разрывался ленточной пилой на несколько частей, которые могли разрушать окружающие анатомические структуры.

                                    

Рис. 3. Пластинированный горизонтальный распил головы через зрительные каналы. Артерии инъецированы красным силиконом. Трехкратное увеличение. 1 – отводящий нерв; 2 – зрительный нерв; 3 – нижняя ветвь глазодвигательного нерва к медиальной прямой мышце глазного яблока; 4 – микрососуды слизистой оболочки верхней стенки клиновидной пазухи; 5 – глазная артерия; 6 – ресничный узел.

При сравнении скорости обезвоживания срезов в разных растворителях установлено, что лучше всего  использовать для дегидратации распилов смесь ацетона с гексаном в соотношении 3:1. По сравнению с этиловым спиртом и чистым ацетоном обезвоживание в этой композиции происходит эффективнее за счет отбора влажного ацетона, оседающего на дно емкости, что позволило сократить продолжительность этапа обезвоживания в 1,5 - 2 раза. Также установлено, что смесь ацетона и гексана обладает лучшими  обезжиривающими свойствами даже при отрицательных температурах. Отмечено, что ректификация ацетоново-гексановой смеси требует меньших энергозатрат, но должна проводится только на взрывобезопасном оборудовании с соблюдением правил противопожарной безопасности. 

Установлено, что глубина импрегнации тканей эпоксидной композицией напрямую зависит от вязкости смолы. Хороших результатов удалось достичь при использовании эпоксидных смол с динамической вязкостью до 15 Па·c.  Применение более вязких смол ухудшало проникновение смолы в ткани и замедляло процесс импрегнации. Добавление в эпоксидную смолу с высокой вязкостью пластификаторов, таких как дибутилфталат, в количестве до 15% от массы готовой композиции, позволило снизить динамическую вязкость смолы до требуемых значений. Ускорению импрегнации способствовало также нагревание вакуумной камеры в термостате и проведение пропитки срезов смолой при температуре от 30 до 40 градусов. Это позволило снизить вязкость эпоксидной композиции и ускорить элиминацию промежуточного растворителя из распилов.

Нами выявлена зависимость прозрачности отвердевших пластинчатых препаратов от коэффициента преломления эпоксидной композиции, использованной для пропитывания срезов. Наилучшие результаты были достигнуты при использовании эпоксидной композиции с коэффициентом преломления 1,52 ± 0,3 единицы. Оправдано применение эпоксидных композиций с разными преломляющими коэффициентами для различных органов, так как разные ткани содержат разное количество жидкости и имеют различные коэффициенты преломления. Использование специальных добавок, таких как диоксид титана, позволяет увеличить коэффициент преломления смолы, а использование пластификаторов и алифатических отвердителей  -  снизить этот показатель.

Установлено, что отверждение импрегнированных срезов в плоских камерах из полиметилметакрилата протекает быстрее при повышенной температуре. Увеличение температуры на 10 градусов позволяло сократить длительность отверждения в среднем в 2 раза. Однако чрезмерное нагревание неотвержденных срезов выше 55ºС может вызывать формирование в препаратах микроскопических пузырьков промежуточного растворителя, что в целом ухудшает демонстрационные свойства пластинатов.

Проведенные исследования позволили выработать оригинальную методику пластинации и выбрать группу эпоксидных смол, отвердителей и пластификаторов для изготовления прозрачных пластинчатых срезов. При пластинации происходит замещение воды и тканевых липидов на эпоксидную композицию, в результате чего мягкие и непрозрачные распилы приобретают твердость и прозрачность. Полученные пластинаты лишены запаха, не подвержены высыханию и разложению, длительно сохраняют анатомические структуры в исходном состоянии и могут быть исследованы визуально и под небольшим увеличением как в проходящем, так и в отраженном свете. Срезы, пластинированные с помощью эпоксидной смолы, не требуют особых условий хранения и их можно использовать в любой аудитории, а также применять для научных морфологических исследований. Однако, по сравнению с полимерным бальзамирование силиконом, изготовление прозрачных пластинированных срезов является более трудоемкой методикой и требует дополнительных приспособлений и оборудования. В то же время, при наличии простого оборудования (холодильная камера, вакуумный насос, вакуумная камера) и соответствующей подготовке персонала, подобная методика не будет сложнее, чем изготовление гистологических микропрепаратов, и может быть внедрена в работу морфологических кафедр и лабораторий.

Для получения наилучших результатов следует изготавливать распилы тела толщиной около 4 мм. Срезы толщиной от 10 до 30 мм получаются непрозрачными и имеют меньшую информативность. Эти срезы можно использовать либо для изготовления пластинчатых моделей целого тела или для разрезания уже готовых, твердых пластин на более тонкие распилы. Нам представляется нецелесообразным изготовление по этой методике пластинатов толщиной более 40 мм.

Мы считаем, что для производства прозрачных пластинатов можно с успехом использовать эпоксидные смолы ЭД-20 и YD-128 с отвердителем ТЭТА, предлагаемые на российском рынке. При выборе других марок необходимо ориентироваться на оптически прозрачные низковязкие эпоксидные смолы с коэффициентом преломления от 1,45 до 1,55 единиц. 

 Несомненно, что прозрачные пластинированные срезы в будущем с успехом заменят традиционные распилы и позволят открыть новые горизонты в морфологических и клинико-анатомических исследованиях.